Southern杂交
实验原理
Southern印迹杂交(Southern blot)是1975年由英国人southern创建,是研究DNA图谱的基本技术。Southern印迹杂交是进行基因组DNA特定序列定位的通用方法。基于第二代测序技术的miRNA测序,可以一次获得数百万条miRNA序列,能够快速鉴定出不同组织、不同发育阶段、不同疾病状态下已知和未知的miRNA及其表达差异,为研究miRNA对细胞进程的作用及其生物学影响提供了有力工具。一般利用琼脂糖凝胶电泳分离经限制性内切酶消化的DNAl片段,将胶上的DNA变性并在原位将单链DNAl片段转移至尼龙膜或其他固相支持物上,经干烤或者紫外线照射固定,再与相对应结构的标记探针进行杂交,用放l射自显影或酶反应显色,从而检测特定DNA分子的含量。
RNA提取及注意事项
研究基因的表达和调控时,需要从组织或细胞中分离纯化RNA。RNA质量的高低经常影响RT-PCR、cDNA库构建和Northern Blot等分子生物学实验的成败。
主要试剂
Trizol是一种新型总RNA抽提试剂,内含异硫酸胍等物质,能迅速破碎细胞,抑制细胞释放出的核酸酶。
1.
Trizol试剂含有,具有毒性和刺激性,注重操作。
2.
RNase污染的主要来源是操作过程中手和空气中的浮沉,注重配带手套,样品尽可能盖严。
3. 细胞裂解必需充分且操作迅速。裂解不完全会降低后得率,因为一部分RNA会残留在未裂解的细胞中。细胞裂解之后要看不见颗粒状物质(结缔组织和骨除外)。在清洗和裂解细胞时在低温下操作,防止在操作过程中释放的内源RNase降解了RNA。
4. 酵母和一些细菌由于细胞壁的特别结构,可以加入Trizol试剂同时加入无RNase的玻璃珠并剧烈振荡,使细胞裂解充分。
2-8℃ 避光保存一年。
RNA提取处理的步骤如下:在玻璃烧杯中注入去离子水,加入DEPC使其终浓度为0.05%~0.1%(DEPC-H2O)。(DEPC二焦碳酸酯为活性很强的物,须在通风橱中小心使用)
将待处理的塑料制品放入一个可以高温灭菌的容器中,注入DEPC-H2O,使塑料制品的所有部分都浸泡到溶液中,在通风柜中37℃ 或室温下处理过夜。
将DEPC-H2O小心倒入废液瓶中,将装有DEPC- H2O 处理过的塑料制品的容器以铝箔封口,高温高压蒸汽灭菌至少30分钟。
灭菌塑料制品烘烤干燥,置洁净处备用。
玻璃和金属物品250 ℃烘烤3小时以上。